Obtaiment of Pudu (Pudu pudu) deer embryos by the somatic nuclear transfer technique

RESUMEN: Los objetivos de este trabajo fueron los de producir embriones de pudú, obtenidos por la transferencia de núcleos de fibroblastos de la oreja de pudú en ovocitos de un rumiante domésticos que es el bovino. Para posteriormente en un trabajo futuro proceder a la transferencia de embriones de pudú, al útero de hembras receptoras sincronizadas de otra especie. Se obtuvieron biopsias de 1 mm aproximadamente del borde externo de la orejas de dos ciervos pudu machos del jardín zoológico Buin-Zoo, Santiago de Chile. Las líneas celulares han sido establecidas y conservadas según los protocolos utilizados para las bovinos. Los ovocitos son obtenidos por punción del complejo cúmulos-ovocito (COC).desde ovarios de vacas recuperados del matadero. Cada ovocito es enucleado y fusionado con un fibroblasto aislado insertado bajo la zona pelúcida. La fusión de membranas celulares es obtenida por choques eléctricos. En cuanto a la cronología, observamos que al segundo día se forma una etapa de dos blastómeras, al tercer día mórulas de 8 a 16 células, y desde el cuarto día se ha diferenciado como blastocisto, el cuál al séptimo día termina por eclosionar de la zona pelúcida.La obtención de blastocistos embrionarios indica que es posible obtener embriones de pudú mediante clonaje heteroespecífico, aunque, el porcentaje de éxito obtenido es relativamente bajo. Queda aun por verificar la viabilidad de los embriones así obtenidos después de la transferencia in útero.

Attempts at Applying Cloning to the Conservation of Species in Danger of Extinction / Intentos de Aplicar la Clonación en la Conservación de Especies en Riesgo de Extinción

The somatic cloning by transfer of the nuclei of differentiated adult cells to previously enucleated oocytes is a promising technique for the production of embryos of high genetic value. The better mastering of somatic cloning gives us the possibility to produce embryos from endangered species. The huemul is an Andean native deer, that has been declared an endangered species, it holds a great patrimonial value and it is a Chilean national emblem. In Chile the huemul has the status of protected animal on thirteen Parks and National Reserves managed by Corporacion Nacional Forestal (CONAF). This protection, however, is considered insufficient due to the few geographical connections between the different protected areas. Furthermore, a great proportion of these areas are not subjected to use or they do not constitute adequate habitats. Many authors have proposed that the use of biotechnological methods in reproduction and assisted procreation may help conservational programs orientated to the protection of deer species threatened by extinction. All the anterior prompted us to initiate this study concerning the production of cloned huemul embryos.

El clonaje somático por transferencia del núcleo de células diferenciadas adultas a un ovocito, al que se le ha extraído el núcleo (enucleado), es una técnica prometedora para la producción de embriones de alto valor genético. El mejor dominio del clonaje somático da la posibilidad de producir embriones de especies amenazadas de extinción. El huemul es un ciervo andino autóctono, declarado como especie en peligro de extinción. tiene un gran valor patrimonial, y es emblema de la nación chilena. En este país, el huemul se encuentra protegido en trece Parques y Reservas Nacionales, manejadas por la Corporación Nacional Forestal (CONAF). Sin embargo, su protección se considera insuficiente debido a la baja conectividad entre las áreas protegidas y además, una gran proporción de estas áreas no son utilizadas o no constituyen un hábitat adecuado. Para las especies de cérvidos en vías de extinción el uso de biotecnología reproductiva y métodos de procreación asistida, según varios autores, pueden ayudar a los programas de conservación. Las técnicas clásicas de producción de embriones basados en superovulación, inseminación artificial y transferencia embrionaria,en los cérvidos, han resultado muy dificultosa. Esto, sumado a las características del huemul, que no permite su estabulación en cautiverio, nos ha movido a iniciar un estudio tendiente a la producción de embriones clonados de esta especie.

Caracterización, aislamiento y cultivo de células germinales primordiales de conejo / Characterization, isolation and culture of rabbit primordial germinal cells

Las células germinales primordiales (CGP) obtenidas directamente del embrión, no son capaces de generar líneas celulares pluripotentes, pero ellas adquieren esta capacidad si son mantenidas en cultivos in vitro. Los objetivos de este estudio fueron: 1) caracterizar inmunohistoquímicamente las CGP de conejo en sus distintas etapas embrionarias in vivo. 2) reconocer el lugar óptimo para obtener estas células según edad embrionaria. 3) evaluar si las células nutricias murinas permiten la proliferación y sobrevivencia de las CGP en cultivo in vitro. Se obtuvieron embriones de 16 conejas de raza Neozelandesa blanca de 7,9,10,14 y 16 días post coito (dpc). Un grupo de cada camada fue procesado in toto y en cortes por congelación con fosfatasa alcalina y dos anticuerpos monoclonales. TEC-1 (reconoce antígeno SSEA-1 de superficie de las CGP) y PG-2 (marca el citoplasma perimitocondrial de CGP. Otro grupo de embriones fue cultivado durante 22 días usando células nutricias STO y MI-220. En embriones de 7 días, el epiblasto del disco embrionario presenta células TEC-1 positivas y PG-2 negativas. Esta marca se mantiene así durante la estadía transitoria en el alantoides y durante la migración a través del meso intestinal. Cuando las CGP colonizan la gónada se transforman en TEC-1 negativas y PG-2 positivas. La capacidad de proliferación in vitro de las células germinales primordiales de conejo, resultó ser mucho menor que la obseervada en ratón. Esto guarda relación con la reducida capacidad de proliferación de estas células in vivo. La eficiencia proliferativa de las CGP in vitro se correlaciona con la edad del embrión del cual ellos derivan. Por otra parte la morfología de las células in vitro guarda también una estrecha relación con la edad del embrión de la cual ellas son aisladas. La edad óptima en la que se obtuvieron mejores proliferación y sobrevivencia es sucesivos pasajes, fue a los 14 días (grupo III). Es decir, en el período en que ellas están proliferando y migrando a través del meso intestinal. Los medios de cultivo de origen murino STO, MI-220 permiten la proliferación y sobrevivencia de las CGP